本发明公开一种基于纳米氧化铜测定脲酶的方法,基于纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶活性,结合脲酶可以选择性水解尿素生成氨和二氧化碳,通过氨抑制纳米氧化铜催化过氧化氢氧化对羟基苯丙酸的过程,减少二聚体荧光产物的生成,提供一种以纳米氧化铜为催化剂测定脲酶的荧光分析方法。其是将尿素、脲酶和磷酸盐缓冲液三者混合温浴进行脲酶酶促反应,然后向其中加入对羟基苯丙酸、过氧化氢、纳米氧化铜和磷酸盐缓冲液继续温浴进行荧光反应,荧光反应产物的最大激发波长和发射波长分别为320 nm和409 nm。测定脲酶的线性范围为0.003~0.04 U/mL,其检测限为2.6 U/L。该方法可用于土壤中脲酶的测定。